CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA
QUE ES CROMATOGRAFIA?
Historia
La cromatografía es un método físico de
separación que permite obtener cada uno de los
componentes de una mezcla, que serían imposibles de separar por otras
técnicas como precipitación, destilación y extracción. Una
técnica cromatográfica acoplada a un detector permite la identificación
y cuantificación de compuestos.
La cromatografía tiene sus principios a
comienzos del siglo XX con el botánico ruso Mikhail S. Tswett, cuyos trabajos
estaban enfocados en la separación de pigmentos vegetales, para esto hizo pasar
soluciones de estos pigmentos a través
de una columna de vidrio empacada con carbonato de calcio. Después de poner la
solución de pigmento en la columna, vertía solvente y mientras la muestra
descendía por la gravedad, se observaban en la columna diferentes bandas de
color debido a que algunos componentes de la mezcla se movían a través de la
columna más rápido que otros.
Tswett denominó esta técnica cromatografía
del griego chroma que
significa color y graph que significa
escribir.
Figura No. 1. Experimento de Tswett
COMO FUNCIONA LA CROMATOGRAFÍA?
CLASES DE
CROMATOGRAFÍAS
Todo
análisis de cromatografía requiere principalmente de dos fases:
La Fase
estacionaria: Es el soporte en el que se realiza la separación de la muestra.
La Fase
móvil: Permite el desplazamiento de la muestra y puede ser líquida, gaseosa ó
un fluido supercrítico, además, es la fase móvil la que define el tipo de
cromatografía, así existe la Cromatografía Líquida, La Cromatografía de Gases y La Cromatografía de Fluidos Supercríticos.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
En cromatografía
líquida la fase estacionaria puede estar dentro de una columna (líquida ó
solida) o depositada sobre una placa (sólida).
Cromatografía de capa delgada.
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Cromatografía de columna ó cromatografía de
elución en columna
|
Un
punto de la muestra es puesta sobre la capa de fase estacionaria y luego la placa es sitúa en un recipiente
que contiene la fase móvil, esta no está aún en contacto con la muestra.
Figura No. 2. Cromatografía de Capa delgada.
Tiempo Cero: Muestra original, Después de X minutos, componentes
individuales.
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La
muestra pasa a través de una columna que contiene la fase estacionaria que puede ser sólida, un
líquido adsorbido por un sólido, especies orgánicas enlazadas a una
superficie, una resina de intercambio iónico o un líquido en los intersticios
de un sólido, igual que en el experimento de Tswett.
Según
la fase estacionaria se tienen diferentes tipos de cromatografía líquida en columna.
Figura No. 3. Cromatografía de Columna.
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La cromatografía líquida en columna, más utilizada, emplea fase estacionaria sólida, y se puede realizar
en una columna abierta, en la cual el flujo del solvente (eluyente) se realiza por vacío o por gravedad, estos rellenos utilizan
partículas que no pueden soportar presión (diámetros ˃50 µm) y de esta forma ofrecen menos resistencia al
flujo. Este procedimiento es conocido como extracción
en fase sólida y se pueden usar tanto columnas abiertas como en el
experimento de Tsweets como cartuchos y tubos en forma de jeringa.
Columnas de rellenos con tamaño de partícula
más pequeños (˂10 µm) se utilizan para mejorar la separación, sin embargo,
estas ofrecen mayor resistencia al flujo
del solvente, por lo que se necesitan altas presiones, para esto se requieren
bombas y columnas que soporten estas presiones. Cuando se requieren presiones altas o
moderadas la técnica se llama cromatografía líquida de alta eficacia ó HPLC por
sus siglas en inglés (High-Performance
Liquid Chromatography).
El término en su principio se debía a las
presiones que se utilizaban que eran 500 psi, siendo cromatografía líquida de altas presiones, sin embargo, con el
avance tecnológico se desarrollaron equipos que soportan hasta 6000 psi de
presión, con los continuos avances el nombre se cambió al actual conservando el
mismo acrónimo.
El método de separación en una cromatografía de
columna se ilustra en la figura No 4.El solvente entra por el lado izquierdo de
la columna y fluye como lo indican las flechas,
inicialmente (Figura No. 4a) la muestra está al inicio de la columna
como una sola banda, tiempo cero (t0) y después de unos minutos durante los que ha
pasado la fase móvil por la columna y ha estado en contacto con la fase
estacionaria, se observan bandas individuales que se han movido a diferentes
velocidades, debido a que los compuestos interaccionan de diferente forma con
las fases. El compuesto amarillo es más compatible con la fase móvil que los
otros compuestos y sale primero de la columna, por otra parte el compuesto azul
tiene mayor afinidad por la fase estacionaria que por la fase móvil, por esto
su movilidad es menor y el compuesto rojo tiene una afinidad
intermedia por las dos fases. Debido al
comportamiento de estos compuestos es posible separarlos usando cromatografía.
Figura 4 a. Tiempo Cero (Inyección) b.
Durante la corrida cromatográfica.
INSTRUMENTACIÓN
Un instrumento típico de HPLC consta de varios
componentes que permiten el análisis de la muestra.
1.
Reservorio
de la fase móvil.
2.
Tuberias
3.
Bomba.
4.
Inyector
5.
Columna
cromatográfica.
6.
Detector.
7.
Registrador
de datos.
8.
Hornos
para la columna (opcional)
9.
Recolector
de fracciones (opcional) permite recolectar las fracciones de compuesto
purificado
Figura No. 5 Esquema de un equipo de HPLC
Figura No. 6. Equipo de HPLC Alliance®. Quimicontrol S. A. Representante en Colombia http://kqmenpublicidad.com/quimicontrol/index.php/marcas/waters
Reservorio: Contienen la fase móvil y se
encuentran por lo general en la parte superior del equipo para que la fuerza de
gravedad dirija el solvente al sistema.
Puede emplearse cualquier recipiente de
laboratorio que sea de vidrio y debe tener una tapa que evite la contaminación
del solvente y en el extremo de la tubo del solvente se coloca un filtro (buzo)
con porosidad de 2 – 10 µm para evitar el ingreso de partículas al sistema.
Tubería: El solvente debe circular por
tuberías que unen todos los componentes del sistema, estas deben ser de un
material inerte y según su posición deben soportar presión, así se utilizan
tuberías de acero inoxidable 316 ó 304 para unir componentes que soportan
presión (bombas, inyector, columna, detector y detectores si están en línea) y
tuberías de polipropileno o teflón donde la presión es baja (reservorio,
desechos).
La tubería de acero
tiene un diámetro externo de 1/16 pulgadas, pero tiene diferente diámetro
interno, la tubería que une componentes por los cuales circula la muestra tiene
menor diámetro, que la que une componentes por donde esta no circula.
Uniones: Las uniones permiten conectar las
tuberías y con ellas todos los componentes del sistema. Consiste de una unión
“macho” que es una férula que se fija en la tubería y un tornillo que se ajusta
a la unión “hembra” de una conexión,
estas dos partes pueden encontrarse separadas o como una sola pieza.
Figura No. 7. Esquema de una unión “macho” –
“hembra”
Las uniones deben ser inertes ante la fase
móvil y las muestras, deben cerrar herméticamente y se deben colocar de tal
forma que no contribuyan al ensanchamiento de banda extracolumnar.
Bombas: Las bombas son las encargadas de
impulsar la fase móvil, para que esta pase del reservorio al inyector y de ahí
a la columna. El flujo de trabajo puede variar según lo requiera el análisis y
básicamente existen dos tipos, las bombas de pistón, más ampliamente utilizadas
y se adaptan al trabajo de rutina y las de desplazamiento continuo, que no
emiten pulsos durante la entrega del solvente.
Inyectores: En HPLC la muestra se carga y luego
es enviada al sistema, esta entra al sistema sin interrumpir el flujo. Las principales características de un inyector
son:
·
Fácil
de operar
·
Inerte
·
Resistente
a altas presiones
·
Exacto
·
Soportar
altas temperaturas (opcional para soluciones de polietilenos)
En la actualidad los inyectores son válvulas de
6 vías que dirigen el caudal hacia la columna, pasando según su posición, a
través de un loop en el cual se introduce la solución a inyectar. Las válvulas
se pueden manipular de modo manual o automáticamente. El loop es
intercambiable, lo que permite introducir una serie de medidas estándar que
generalmente van desde 50 hasta 200 µL.
Los inyectores, ya sean, de tipo manual o
automático tienen una posición de carga y otra de inyección.
1. Posición
de carga (Figura 8 a) se llena el loop y lo que sobra va a los desechos. La
fase móvil se dirige desde la bomba hacia la columna.
En un inyector manual el rotor se encuentra en
la posición de carga (load) es aquí cuando se inserta la jeringa en el orificio
y se inyecta el contenido en el inyector, en este caso se debe inyectar un
volumen de muestra igual o mayor a 5 veces la capacidad del loop para purgarlo
y asegurar que quede limpio, la muestra que sobra va a los desechos.
El automuestreador permite inyectar la cantidad
que se necesite en el análisis, esta puede ser menor que la capacidad del loop,
pues al ser automático va a evitar imprecisiones en los resultados por error del
analista, en este sistema también se hace la purga del loop antes de la
inyección.
2. Posición
de inyección de la muestra (figura 8 b): La fase móvil que viene de la bomba
pasa por el loop y empuja la muestra hacia la columna.
Para la inyección manual el rotor se mueve a la
posición de inyección (inject) sin quitar la jeringa del orificio después de
esto se puede retirar la jeringa y se devuelve el rotor a la posición de carga.
Figura No. 8 a. Posición de carga del inyector . b.
Posición de Inyección
Detectores: El detector es el componente que
permite “ver” cada banda de compuesto de forma separada contra un background
(Línea base) de la fase móvil. Un detector adecuado debe tener las siguientes
características:
·
Sensible,
debe ser capaz de detectar concentraciones bajas.
·
Rango
dinámico de respuesta: debe leer desde concentraciones muy bajas, hasta
concentraciones altas.
·
Preferiblemente
no debe dañar la muestra, es necesario cuando se requiere recoger las
fracciones.
·
Estable
respecto a la temperatura
·
Respuesta
lineal
·
Alta
relación señal/ruido
· No Contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar. Debe tener un volumen interno mínimo (tamaño de celda y longitud de tubería)
·
Alta
velocidad de respuesta
·
Responder
a todos los solutos
Los detectores pueden ser selectivos que miden
una propiedad del analito ej, detector de UV o pueden ser generales, que
comparan una propiedad de la fase móvil cuando está puro y cuando hay algo que
la cambia, ej, detector de índice de refracción.
Detectores Generales.
Detector de Índice de
Refracción. Mide la diferencia en el índice de refracción cuando la fase móvil está
limpia y cuando trae el soluto. En este detector no se puede hacer cambio de
fase móvil durante la corrida y se debe tener mucho cuidado con la limpieza de
la misma. La lectura se afecta por la temperatura lo que obliga a controlar las
condiciones ambientales.
Figura No. 9. Detector de Índice de Refracción.
Detectores Específicos.
Detectores Ultravioleta. Son los detectores más utilizados, pues permiten determinar un amplio rango de analitos, no son destructivos, ni sensibles a la temperatura y se pueden usar con gradiente con la única exigencia
de que este sea invisible a la longitud de onda de detección del analito. La longitud de onda de trabajo va desde 190 hasta 350 nm, para el análisis de un determinado compuesto es necesario encontrar la longitud de onda de
máxima absorción del analito y también los rangos de concentración en los que la respuesta es lineal. Existen dos tipos de detectores de UV, los de onda fija y los de onda variable.
Detector de onda fija. Este detector posee una lámpara de
mercurio, como longitud de onda se utiliza las bandas de emisión del mercurio,
especialmente la línea a 254 nm. El monocromador es la emisión de la lámpara,
pero para eliminar líneas de otras longitudes de onda se utilizan filtros de
interferencia. Suelen utilizarse filtros que permiten trabajar a otras
longitudes de onda.
Detector de onda
variable o espectrofotométrico. Trabaja como un
espectrofotómetro, con una lámpara de Zenón o Deuterio , la luz emitida por la
lámpara se enfoca en un monocromador, de allí pasa a la celda y finalmente
llega a un fotomultiplicador.
Un adelanto de los detectores
espectrofotométricos es el arreglo de
diodos, en este caso la muestra recibe luz blanca, es decir todas las
longitudes de onda, la luz que emite llega a la red de difracción y de allí es
dispersada hacia el elemento fotosensible. Toda esta información es procesada
por un software adecuado.
Figura No. 10 Detector de arreglo de Diodos.
Detector de
Fluorescencia. Se
utiliza para sustancias que presentan fluorescencia ya sea de forma natural o
debido a reacciones de derivatización con un reactivo fluorogénico. Es
altamente sensible y específico, lo que lo convierte en un buen detector para
análisis de trazas. Se utilizan dos
longitudes de onda, una de excitación y otra de emisión, aunque muchos componentes de la muestra absorban a la
longitud de onda de absorción, pocos emitirán a la longitud de onda escogida
para la emisión. Generalmente se utiliza
una lámpara de Xenón.
Figura No. 11. Detector de Fluorescencia.
Detector
electroquímico. Es un detector más selectivo y
sensible que el de UV, no sólo detecta compuestos que pueden ser reducidos u
oxidados, sino que con una buena elección del potencial, el número de los
compuestos detectados puede reducirse.
Este detector emplea 3 electrodos, uno de referencia, uno de trabajo y
uno auxiliar.
Sus principales limitaciones consisten en la
elección de la fase móvil, que debe ser conductora y en que destruye la
muestra.
Registrador de datos: Transforma las señales eléctricas
del detector en un gráfico de señal vs tiempo llamado cromatograma, el cual nos
representa la separación que ocurrió en el cromatógrafo
Cada pico del cromatograma representa la
respuesta del detector a un compuesto diferente. La figura No. 12 muestra un
cromatograma, en el se observa la línea
base que representa la fase móvil que atraviesa la celda todo el tiempo
desde la inyección (t0) y los picos que aparecen en un tiempo
característico llamado tiempo de retención
(tr), un pico bien definido empieza en la línea base, llega hasta el
valor máximo registrado por el detector y vuelve a la línea base.
Figura No. 12. Cromatogramas, utilizados para
identificar y cuantificar un analito.
Al comparar el tiempo de retención de una
muestra desconocida con el de un estándar, es posible hacer la identificación de compuestos, ya
que, bajo ciertas condiciones cromatográficas cada compuesto tiene un tr
determinado, así el tiempo de retención indica que compuesto es y después de
identificar se puede conocer la concentración del analito, pues el detector
responde a la concentración del analito, cuanto más concentrado sea, mayor es
su señal.
Fase móvil: Los solventes utilizados para
análisis de HPLC deben cumplir con las siguientes especificaciones.
·
Alto
grado de pureza, solventes grado HPLC
·
Debe
ser desgasificado, no pueden haber burbujas en el sistema que afecten la
separación.
·
Debe
solubilizar la muestra.
·
Tener
baja reactividad
·
Compatible
con el detector, no debe generar ningún tipo de señal
·
No
puede evaporarse a la temperatura de trabajo
·
Debe
tener baja viscosidad para que fluya por todo el sistema.
·
Debe
ser seguro para el trabajo en el laboratorio, es decir no deben ser
inflamables, ni muy volátiles.
Las fases móviles se pueden preparar a partir
de varios solventes pero estos deben ser miscibles entre ellos, deben formar
una sola fase, si se preparara una fase móvil a partir de varios solventes se
debe hacer en material volumétrico limpio, además los solventes se deben pasar
por un filtro de 0.22 µm y 0.45 µm para
eliminar partículas y bacterias respectivamente y desgasificar.
En HPLC la fase móvil es la que gobierna la
separación y esta compite con la fase estacionaria para sacar los compuestos de
la columna y finalmente obtener los compuestos puros. Con la fase móvil se
puede trabajar en dos formas de elución: isocrática, en la cual la fase móvil puede ser un
solvente puro o una mezcla de solventes y esta permanece constante durante toda
la corrida cromatográfica, un típico sistema isocrático se muestra en la figura
No. 5
El otro sistema se llama gradiente y como su nombre lo indica la fase móvil cambia durante
la corrida, este método es útil para muestras que contienen componentes con
polaridades diversas. Mientras se da la separación la fuerza del eluyente se
incrementa, es decir la fase móvil ofrece mayor competencia a la fase
estacionaria, esto obliga la elución del compuesto que está más fuertemente
retenido a la fase estacionaria.
El sistema de elución por gradiente puede ser
de alta o baja presión.
En el
sistema de alta presión se tiene una bomba para cada solvente, la velocidad
de cada bomba se maneja según el gradiente que se necesite así envía la
cantidad de solvente que se requiere durante la corrida, luego los solventes
son combinados en el mezclador para crear la fase móvil, que es enviada a la
columna. Figura No. 13
El sistema de baja
presión sólo tiene
una bomba que va después del mezclador. Una válvula de gradiente escoge la
cantidad de solvente de cada una de las botellas, cambiando la fuerza de la
fase móvil durante el tiempo. Este sistema requiere la desgasificación continua
de cada solvente. Figura No. 14
Figura No. 14. Esquema de gradiente de baja
presión
Columna: es el corazón de la cromatografía,
pues es el lugar donde se da la separación, por esto es fundamental escoger la columna para el análisis.
Las columnas y las conexiones que contienen la
fase estacionaria deben soportar la presión que se utiliza tanto en su
fabricación como en el análisis, además deben proveer un flujo controlado de la
muestra desde su entrada hasta la salida, debe mantenerse libre de fugas y no
deben tener volumen muerto. La mayoría de columnas están compuestas por un tubo
de acero inoxidable, aunque también se pueden utilizar columnas de PEEKTM y
de vidrio, que toleran menos presión pero son necesarias cuando se requiere de
una superficie inerte para aplicaciones especiales.
Las características de una columna que influyen
en la separación son:
·
Diámetro
interno
·
Longitud
·
Relleno
·
Conexiones
·
Tamaño
de partícula del relleno.
El volumen de la columna (Vc), es una
propiedad que depende de la longitud y del diámetro interno e indica la
cantidad de material de relleno que puede contener la columna, este determina
la cantidad de muestra que se puede inyectar.
En general las columnas de HPLC varían en
longitud desde 20mm hasta 500 mm y diámetro interno entre 1 mm y 100 mm.
Mientras la escala de la cromatografía incrementa, las dimensiones de la columna
también, especialmente el área de sección transversal.
HPLC genera datos analíticos que permiten identificar
y cuantificar compuestos, para lo cual se utilizan columnas con diámetro
interno (i.d) entre 1 y 8 mm y longitud (L) entre 20 y 300 mm, sin embargo, también
permite obtener compuestos puros y colectarlos, este proceso se conoce como cromatografía preparativa y requieren
columnas de mayor diámetro interno y longitud (i.d¡= 50 – 100 mm y L= 20 - 500
mm)
Un método cromatográfico es adecuado si es
posible obtener picos bien separados o resueltos. La resolución cromatográfica
depende del poder de separación mecánica y química del sistema.
El poder de separación
mecánica (también
conocido como eficiencia ó platos teóricos (N)) depende directamente de la
longitud de la columna y la uniformidad del empaquetamiento e inversamente del
tamaño de partícula, es decir una columna más larga y con un tamaño de
partícula menor, dará como resultados picos mejor separados y más angostos, sin embargo una
columna más larga, alargará también el tiempo de la corrida y el consumo de
solvente y un tamaño de partícula menor requiere mayor presión de trabajo, por
lo que es importante decidir el cambio que se puede realizar, según el sistema
cromatográfico disponible.
El poder de separación
química ó selectividad depende de la escogencia entre la fase móvil y la estacionaria.
TIPOS DE SEPARACIONES
EN HPLC
Las separaciones en HPLC se pueden realizar por
polaridad, carga eléctrica o tamaño molecular.
Por polaridad se conocen dos tipos de cromatografías:
Fase reversa: En la que la fase móvil es altamente polar y la fase estacionaria tiene baja polaridad respecto a la fase móvil, generalmente se usan columnas C18 o C8 (hacen referencia a la cadena de carbonos unidos a la sílica gel) y la fase móvil más común es agua y metanol. Este es el tipo de separación más usado en HPLC.
Fase normal: Es la utilizada en los inicios de la
cromatografía, en la cual la fase móvil tiene baja polaridad con respecto a la
fase estacionaria que es altamente polar, generalmente se usan columnas con
rellenos de sílica ó alúmina y solventes como hexano.
Separaciones por carga eléctrica.
Cromatografía de intercambio iónico. Las fases estacionarias son
caracterizadas por su carácter ácido o básico sobre sus superficies y el tipo
de iones que atraen. La fase móvil debe cambiar de pH para forzar la salida de
los compuestos iónicos que están siendo retenidos por la fase estacionaria.
Separaciones por tamaño,
Cromatografia de permeación por gel y
cromatografía de exclusión por tamaño. Estas técnicas cromatográficas se realizan en
fases estacionarias que han sido sintentizadas con una distribución de tamaño
de poro que permite al analito entrar y salir de estos poros, las moléculas
pequeñas penetran más poros y su paso por la columna se ve retrasado, respecto
a las moléculas grandes que no pueden penetrar todos los poros de la fase
estacionaria y eluyen primero.
Mediante esta técnica es posible determinar el
peso molecular de compuestos poliméricos.
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REFERENCIAS
Arsenault,
J., & McDonald, P. P. (2009). Beginners Guide to Liquid Chromatography. Milford: Waters Corporation.
Quattrocchi, O. A., Abelaira de Andrizzi,
S., & Laba, R. F. (1992). Introducción a la HPLC. Aplicación y Práctica. Buenos Aires:
Artes gráficas Farro S.A.
Skoog, D., James, H., & Thimothy, N.
(2001). Principios de Análisis Instrumental. Madrid: McGRAW- HILL.
